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Polymerase Chain Reaction

PCR (Polymerase Chain Reaction)은 내열성 DNA 중합효소를 이용하여, 특정 유전자를 분석 혹은 유전자 조작 (Genetic Engineering) 가능한 수준으로 증폭하는 방법입니다. 온도 cycling을 통하여, 증폭 부위 양 말단에 해당하는 염기서열을 가진 primer 쌍이 증폭 대상 DNA에 결합하고, 중합되고, 다시 떨어지는 과정을 반복하면서 특정 부위의 DNA를 기하급수적으로 합성해내는 과정입니다.

Multiplex PCR

Multiplex PCR은 복수의 primer쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법입니다. 이 경우 Primer의 상호 작용을 계산하여 primer가 dimer를 형성하거나 상호간에 간섭을 하지 않도록 하여야 하며, 증폭된 산물은 각각의 크기를 달리하여 agarose gel 상에서 구분될 수 있어야 합니다.

multiplex PCR의 원리

Multiplex PCR은 동일한 검체에서 검출 가능한 다수의 유전자가 있을 경우 유용하게 사용되며, 한번의 검사로 다수의 병원균 및 유전자형을 판별할 수 있어 시간과 비용을 줄일 수 있습니다. 한번의 검사로 다수의 성병 원인균을 검출할 수 있는 STD 진단키트, HPV 감염 여부 및 유전자형 판별, 결핵균의 감염 여부와 약제 내성을 판별하는데 사용되고 있습니다. 또한 STR 마커를 이용하여 법의학, 친자 확인 등에도 사용됩니다.

기술적용

  • PCR kit

Real-time PCR

Real time PCR 은 PCR 과정 동안 증폭된 DNA 산물의 양을 실시간으로 모니터링할 수 있는 실험 기법으로 정확한 정량이 가능하여 유전자 발현 해석과 같은 정량 분석뿐만 아니라 병원균 감염 진단과 같은 정성 분석에도 다양하게 활용되고 있습니다. Real Time PCR은 PCR 증폭산물의 양을 형광을 이용하여 검출하는데, SYBR Green 계열의 형광물질과 TaqMan Probe가 대표적으로 사용됩니다. SYBR Green 형광은 DNA 이중 나선에 결합하여 형광을 나타내는 물질로 비용이 저렴한 장점을 가지지만 비특이적 증폭 산물에도 반응하는 단점을 가지고 있습니다. 이를 극복하기 위하여 증폭이 끝난 후 증폭된 DNA 산물에 대해 melting curve를 측정하여 비특이적 증폭 여부를 판별합니다.

Real-time PCR의 원리

TaqMan probe를 이용한 Real time PCR 은 PCR 증폭을 위한 한쌍의 primer 외에 증폭 대상 부위의 중간에 위치하는 TaqMan probe가 추가로 요구 됩니다. TaqMan Probe의 5undefined end에는 형광물질(Reporter)이, 3undefined end에는 형광을 흡수하는 Quencher가 결합되어 있어, Annealing과정 중에는 Quencher에 의해 발현된 형광이 흡수되지만 이어지는 Extension 과정에서 Taq DNA polymerase의 5undefinedundefined3undefined exonuclease의 작용으로 5undefined 에 붙어 있던 형광물질이 probe에서 떨어져 나오면서 형광을 발현합니다. 이 형광량을 측정하면 target 유전자의 증폭량을 측정할 수 있습니다.

TaqMan probe 를 이용한 방법은 SYBR Green 형광 물질을 이용하는 방법에 비하여 반응특이도(specificity)가 높아 진단에 많이 사용되고 있습니다.

기술적용

  • PCR kit

ASO PCR

ASO (Allele Specific Oligonucleotide) PCR 은 DNA염기서열 상의 유전적 변이를 확인할 수 있는 PCR 기법입니다. 대립유전자의 염기서열을 근거로, 각각의 변이된 염기에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 primer 를 이용하여 변이의 유무를 PCR로 분석할 수 있습니다. ASO PCR에 사용되는 Primer의 경우 3' 말단의 한 개의 염기가 각각의 Allele에 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하여 변이의 유무에 따라 DNA 증폭 여부가 결정되며, PCR 증폭 산물의 생성 유무를 통하여 유전자 변이의 종류를 판별하게 됩니다.

ASO PCR의 원리

ASO PCR 방법을 통해 수행할 수 있는 대표적인 실험은 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 의 분석입니다. SNP 란 세포핵 속의 염색체가 갖고 있는 30억개의 염기 서열 중 개인의 편차를 나타내는 한 개 또는 수십 개의 염기변이를 말합니다. 인간은 99.9% 유전자가 일치하지만 0.1%의 SNP 차이 때문에 키와 피부색 등이 달라지게 됩니다. 한국인이 서양인에 비해 위암과 간암에 잘 걸리는 것도 이러한 차이에서 기인하고 있습니다. SNP가 단백질을 만드는 부분에 있을 경우 엉뚱한 단백질을 만들어 치명적 질병을 일으킬 수 있으며, 혈우병 역시 단 하나의 염기변이로 일어납니다.

기술적용

  • PCR kit

Methylation Specific PCR (MSP)

Human DNA는 CpG 염기 서열의 Cytosine 에 methylation 이 될 수 있으며, 이를 통하여 유전자 발현이 조절됩니다. 특히 유전자 발현 조절 부위인 promoter 영역에는 CpG dinucleotide 가 다수 존재하는 CpG island가 존재하는데, 정상적으로 발현되는 유전자의 CpG island 영역은 methylation 이 되어 있지 않습니다. Hypermethlyation 혹은 hypomethylation은 tumor suppressor gene의 억제 또는 oncogene의 발현 등으로 암을 유발하는 원인이 되고 있습니다. Methlylation 여부에 따라 특정 염기서열의 PCR 증폭 여부가 결정되는 Methylation Specific PCR (MSP) 방법을 통하여 특정 유전자의 methylation에 의한 암 유발 인자를 검사할 수 있습니다.

Methylation Specific PCR의 원리

Methylated DNA에 bisulfite를 처리하면 methylation 되지 않은 cytosine이 uracil로 바뀌게 됩니다. 이를 이용하여 특정 염기서열 부위가 methylation 되어 있는지를 PCR을 통하여 확인할 수 있습니다. Methylation 된 경우를 생각하여 PCR primer를 제작하면 methylation 되어 있을 경우 PCR 증폭이 되며, methylation 되지 않은 경우를 가정하여 PCR primer를 제작하면 methylation 되었을 경우엔 PCR 증폭이 되지 않습니다.

기술적용

  • PCR kit